Логотип 1nep.ru
facebook vk.com youtube
Регистрация
Статьи

Экспериментально-клинические исследования дермамодулятора Aquashine

2664
Экспериментально-клинические исследования дермамодулятора Aquashine

Проведены экспериментально-клинические исследования эффективности пептидного комплекса Aquashine.

Специалистам, Медицинские изделия и препараты

Специалисты Института красоты Fijie совместно с лабораторией клеточных технологий Института акушерства и гинекологии имени Отта и научно-исследовательским центром CAREGEN, провели исследование влияния препарата Aquashine на фибробластах кожи человека.

Зарема Газитаева 
врач, пластический хирург, 
Институт красоты Fijie


Дермамодулятор Aquashine, разработанный на основе запатентованных биомиметических пептидов, трофического комплекса и гиалуроновой кислоты специалистами концерна Caregen, обладает высокой эффективностью и демонстрирует превосходные клинические результаты. Это подтверждают приведенные ниже исследования о влиянии препарата на кожу, проводимые в рамках предрегистрационного исследования.

Материалы и методы

Эксперимент 1

С помощью иммуноцитохимических методов исследовали влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию сигнальных молекул в культуре фибробластов человека (7-й и 15-й пассажи). 7-й пассаж соответствует зрелой коже, а 15-й – увядающей. Применяли первичную культуру клеток, фибробласты выделяли из кожи век, полученной в результате блефаропластики, проведенной женщине 45 лет. Исследуемый комплекс добавляли в культуру из расчета 2 мкг/мл на чашку Петри; в качестве контроля применяли физиологический раствор в эквивалентных дозах.

Эксперимент 2

Определяли иммуногистохимические маркеры в биоптатах кожи человека до и после интрадермального введения препарата Aquashine на разных сроках: через 1 и 2 недели после однократного введения, а также через неделю после двукратного введения (с интервалом в 2 недели). Пациентке за месяц до проведения абдоминопластики с ее ведома и согласия, вводили исследуемый препарат в удаляемые впоследствии участки кожи правой половины передней брюшной стенки ниже пупка. Одновременно в зоны на левой стороне живота еженедельно ей вводили гель гиалуроновой кислоты (средний молекулярный вес – 1 000 000 Да, концентрация – 1%) с использованием папульной техники. Площадь обработки кожи каждым из препаратов составляла 20 см2, количество инъецируемого препарата 0,2 мл. Во время операции были взяты образцы кожи, фиксированы в растворе формалина и направлены в лабораторию. После окрашивания гематоксилином и эозином срезы исследованы иммуногистохимически с применением специфических антител.

Результаты исследования

Гистологическое исследование

На микрофотографиях было проведено измерение площади коллагеновых и эластиновых волокон (окрашенных в розовый цвет) и межклеточного вещества (светлые участки).

Чем больше площадь волокон по отношению к межклеточному веществу, тем больше коллагеновых волокон в образцах (рис. 1).

Было установлено, что максимальная площадь волокон по отношению к матриксу наблюдалась в образцах, прошедших двукратную обработку Aquashine, что проявлялось в увеличении толщины и плотности коллагеновых волокон. Максимальная площадь матрикса по отношению к площади коллагеновых и эластиновых волокон выявлена в образце, прошедшем обработку гиалуроновой кислотой.

Окраска гематоксилином и эозином
РИС. 1. Окраска гематоксилином и эозином. а – контроль, б – после применения Aquashine (микрофотографии образцов кожи; увеличение × 100)

Иммуногистохимическое исследование

Проколлаген

Для изучения синтетической активности фибробластов дермы было проведено исследование экспрессии проколлагена I типа – предшественника основного компонента внеклеточного матрикса, коллагена I типа. Измерялась оптическая плотность экспрессии, которая характеризует интенсивность иммуногистохимической реакции в препарате, является наиболее информативным показателем для данного маркера и косвенно позволяет судить о количестве исследуемого вещества в препарате.

Проколлаген – внутриклеточный предшественник коллагена, синтезируемый на полирибосомах, связанных с мембранами эндоплазматической сети. Макромолекула проколлагена состоит из трех спиралевидных, скрученных между собой белковых молекул. Проколлаген содержит дополнительную пептидную последовательность, которая называется пропептид и находится на амино- и карбоксильных концах. Когда макромолекулы покидают фибробласт, специальные ферменты «откусывают» активные группы и создают условия для образования коллагеновых волокон. Макромолекулы-нити, скручиваясь по пять штук, образуют филамент коллагена; несколько филаментов скручиваются и составляют фибриллу, которая, также скручиваясь, образует высокопрочный «канат» – коллагеновое волокно.

В исследованиях in vitro было выявлено достоверное усиление синтетической активности фибробластов на 7-м пассаже при применении пептидного комплекса по сравнению с контролем. Отмечалось увеличение проколлагена I типа не только по площади экспрессии, но и по показателю оптической плотности (рис. 2, табл. 1).

Максимальное значение показателя оптической плотности экспрессии проколлагена I типа in vivo наблюдалось при двукратной обработке препаратом и составляло 0,285 у.е., оно также было высоким при однократной обработке. Минимальное значение оптической плотности отмечено в контрольных образцах (рис. 3).

Группы

Относительная площадь
экспрессии, %
7-й пассаж

Оптическая плотность
экспрессии,
у.е

Относительная
площадь экспрессии, %
15-й пассаж

Оптическая плотность
экспрессии,
у.е

Контроль

17,58±2,27

0,098±0,02

3,37±0,67

0,095±0,03

Aquashine

24,82±1,58*

0,113±0,03*

12,07±1,25*

0,125±0,03*

* р <0,05 по сравнению с контролем

ТАБЛИЦА 1. Влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию проколлагена I типа в культуре фибробластов in vitro на 7-м и 15-м пассаже

Экспрессия маркера проколлагена в культуре фибробластов на 7-м пассаже
РИС. 2. Экспрессия маркера проколлагена в культуре фибробластов на 7-м пассаже. Иммуноцитохимическое исследование; а – контроль, б – после применения Aquashine (увеличение × 200)

Иммуногистохимическая реакция на проколлаген
РИС. 3. Иммуногистохимическая реакция на проколлаген; а – контроль, б – после применения Aquashine (микрофотографии образцов кожи; увеличение × 400, докраска гемотоксилином)

AP-1

C возрастом увеличивается содержание проколлагена III типа в крови, что свидетельствует о процессе деградации соединительной ткани. Образование и стабилизация коллагеновых волокон обусловлены не только синтезом проколлагена фибробластами кожи, но и замедлением процесса деградации коллагена. Одним из основных соединений, регулирующих разрушение коллагеновых волокон, является транскрипционный фактор АР-1, который контролирует активность генов, кодирующих матриксные металлопротеиназы (ММР-1, ММР-2, ММР-3), повышая уровень их экспрессии. В результате происходит деградация различных типов коллагена дермы и параллельно с этим – активизация фактора АР-1, приводящая к уменьшению количества проколлагена I и III типа.

Транскрипционный фактор АР-1 (активизирующий протеин-1), состоящий из белков Fos- и Jun-семейств, регулирует экспрессию генов в ответ на разные стимулы, в том числе воздействие цитокинов, факторов роста, стресса, бактериальных и вирусных инфекций. Кроме того, АР-1 контролирует ряд клеточных процессов, запуская дифференциацию, пролиферацию и апоптоз, а также синтез ММР, разрушающих коллаген.

При введении пептидного комплекса в культуру фибробластов отмечалось статистически достоверное снижение площади экспрессии АР-1 в 2,1 раза по сравнению с контролем, причем на 15-м пассаже она была наиболее низкой и составляла 4,98±0,67% (рис. 4).

В образцах кожи, обработанных препаратом Aquashine, наблюдалась тенденция к снижению площади экспрессии транскрипционного фактора АР-1, она варьировалась от 2 до 6%, в то время как в образцах контроля была в пределах 7–14% (рис. 5, табл. 2).

Группы

Относительная площадь
экспрессии, %
7-й пассаж

Относительная
площадь экспрессии, %
15-й пассаж

Контроль

5,12±0,42

7,12±0,52

Aquashine

2,08±0,11*

4,98±0,67*

* р <0,05 по сравнению с контролем

ТАБЛИЦА 2. Влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию транскрипционного фактора АР-1 в культуре фибробластов in vitro на 7-м и 15-м пассаже

Экспрессия маркера АР-1 в культуре фибробластов на 15-м пассаже
РИС. 4. Экспрессия маркера АР-1 в культуре фибробластов на 15-м пассаже. Иммуноцитохимическое исследование; а – контроль, б – после применения Aquashine (увеличение × 200)

Иммуногистохимическая реакция на АР-1
РИС. 5. Иммуногистохимическая реакция на АР-1; а – контроль, б – после применения Aquashine (микрофотографии образцов кожи; увеличение × 400)

Ki-67

Белок Ki-67, являющийся маркером клеточной пролиферации и роста клеточной популяции, присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2 и митозе), но отсутствует в покоящихся клетках (G0). С возрастом наблюдается уменьшение экспрессии Кi-67 в фибробластах, в старых клетках он не индуцируется в ответ на действие фактора роста тромбоцитов PDGF (от англ. Platelet-derivedgrowthfactor), хотя эффективно воздействует на клетки молодых субъектов. Проведенные исследования показали, что в культуре фибробластов на 7-м пассаже отмечались статистически достоверные различия между опытной и контрольной группами по показателю процентного соотношения площади экспрессирующих Ki-67 ядер к общей площади ядер культуры. При введении в культуральную среду пептидного комплекса выявлено увеличение данного показателя по сравнению с контролем в 2, 3 раза (рис. 6), в то время как на 15-м пассаже – двукратное увеличение (рис. 7).

Таким образом, при добавлении пептидного комплекса даже в стареющие культуры наблюдается стимуляция деления фибробластов (табл. 3).

Параллельно с этим при исследовании маркера пролиферации клеток Ki-67 в образцах кожи in vivo показано, что наиболее интенсивное деление фибробластов наблюдалось после двукратного введения Aquashine, тогда как делящиеся клетки практически отсутствовали в контрольных образцах (рис.8).

Экспрессия маркера Ki-67 в культуре фибробластов на 7-м пассаже
РИС. 6. Экспрессия маркера Ki-67 в культуре фибробластов на 7-м пассаже. Иммуноцитохимическое исследование; а – контроль, б – после применения Aquashine (увеличение × 200)

Экспрессия маркера Ki-67 в культуре фибробластов на 15-м пассаже
РИС. 7. Экспрессия маркера Ki-67 в культуре фибробластов на 15-м пассаже. Иммуноцитохимическое исследование; а – контроль, б – после применения Aquashine (увеличение × 200)

Группы

Относительное число
иммунопозитивных ядер, %
7-й пассаж

Относительное число
иммунопозитивных ядер, %
15-й пассаж

Контроль

20,85±4,36

15,63±3,43

Aquashine

47,58±4,78*

33,30±4,61*

* р <0,05 по сравнению с контролем

ТАБЛИЦА 3. Влияние пептидного комплекса Aquashine на пролиферативную активность фибробластов в культуре клеток in vitro на 7-м и 15-м пассаже (тестировано по Кi -67)

Иммуногистохимическая реакция на маркер Ki-67
РИС. 8. Иммуногистохимическая реакция на маркер Ki-67; а – контроль, б – после применения Aquashine (микрофотографии образцов кожи; увеличение × 400)

Sirt-6

Маркер Sirt-6 относится к семейству сиртуинов – НАД-зависимых белков, обладающих деацетилазной или АДФ-рибозил трансферазной активностью.

Sirt-6 – регулятор транскрипции стабильности генома, теломерной целостности, репарации ДНК и метаболического гомеостаза – имеет важное значение для послеродового развития человека. Израильские ученые установили, что белок из семейства сиртуинов ассоциирован с увеличением продолжительности жизни млекопитающих. Результаты нового исследования, опубликованные в журнале Nature, свидетельствуют о том, что повышение экспрессии гена на 15,8% увеличивает продолжительность жизни мышей самцов. SIrt-6, ослабляя действие NF-κB (от англ. Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла), ингибирует клеточное старение.

Sirt-6 также играет важную роль в регуляции старения и долголетия. У нокаунтных по Sirt-6 мышей (с удаленными или неработоспособными данными генами) наблюдалось преждевременное старение, тяжелая лимфопения, потеря подкожного жира, остеопения и нарушение обмена веществ.

Введение в культуру фибробластов пептидного комплекса на 7-м пассаже незначительно сказывается на содержании Sirt-6, в то время как на 15-м пассаже – заметно его увеличивает, что говорит об активизации защитных механизмов преимущественно в стареющих клетках (рис. 9, табл. 4).

В образцах кожи in vivo также отмечается значительное увеличение содержания Sirt-6 после инъецирования препарата по сравнению с контролем, что свидетельствует о повышении выживаемости клеточного пула фибробластов увядающей кожи. Анализ площади экспрессии иммунопозитивных ядер по Sirt-6 показал, что во всех образцах кожи, обработанных препаратом Aquаshine, определялось увеличение количества иммунопозитивных ядер по отношению к контрольным образцам (гель гиалуроновой кислоты) (рис. 10).

Экспрессия маркера Sirt-6 в культуре фибробластов на 15-м пассаже
РИС. 9. Экспрессия маркера Sirt-6 в культуре фибробластов на 15-м пассаже. Иммуноцитохимическое исследование; а – контроль, б – после применения Aquashine (увеличение × 200)

Иммуногистохимическая реакция на маркер Sirt-6
РИС.10. Иммуногистохимическая реакция на маркер Sirt-6; а – контроль, б – после применения Aquashine (микрофотографии образцов кожи; увеличение × 400)

Группы

Относительное число
иммунопозитивных ядер, %
7-й пассаж

Относительное число
иммунопозитивных ядер, %
15-й пассаж

Контроль

9,85±0,51

2,05±0,44

Aquashine

12,13±2,06*

10,08±0,57*

* р <0,05 по сравнению с контролем

ТАБЛИЦА 4. Влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию фактора Sirt-6 фибробластами в культуре клеток in vitro на 7-м и 15-м пассаже

Выводы

Результаты данного исследования убедительно демонстрируют эффективность пептидного комплекса Aquashine и подтверждают ее объективными морфологическими исследованиями.

Исследованные параметры имеют неразрывную связь с клиническими проявлениями старения кожи и борьбы с ними.

Эластичность и упругость кожи. Под действием пептидного комплекса Aquashine значительно повышается синтетическая активность фибробластов, что подтверждается повышенной экспрессией проколлагена I типа.

Ускорение сниженных темпов обновления. Пептидный комплекс Aquashine в дозе 2 мкг/мл активизирует пролиферативную активность фибробластов кожи.

Повышение выживаемости клеточной популяции, замедление старения. Инкубация фибробластов кожи человека с пептидным комплексом Aquashine активизирует синтез Sirt-6. Это свидетельствует о запуске механизма поддержания стабильности ДНК, защиты теломер и других процессов, препятствующих старению.

Дермапротекция, защита от агрессивного воздействия свободных радикалов.

Пептидный комплекс Aquashine способствует достоверному снижению экспрессии транскрипционного фактора АР-1 по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о протективном действии исследуемых веществ, реализуемом посредством защиты коллагеновых волокон от деградации.

Проведенные исследования убедительно продемонстрировали высoкую активность препарата. Это позволяет с позиций доказательной медицины экстраполировать полученные результаты на клиническое использование и прогнозировать выраженный эффект лифтинга, уплотнения кожи и ее омоложения при использовании Aquashine в программах anti-age коррекции.

Рекомендуемая литература

  1. Ameyar M., Wisniewska M., Weitzman JB. A role for AP-1 in apoptosis: the case.
  2. Chen J., Zhou Y., Mueller-Steiner S., Chen LF.,Kwon H., Yi S., Mucke L., Gan L. Sirt-1 protectsagainst microglia-dependent amyloid-beta toxicity through inhibiting NF-kappaB.
  3. Hess J., Angel P., Schorpp-Kistner M. AP-1subunits: quarrel and harmony among siblings.J. Cell.Sci. 2004, 117 (Pt 25), рр. 5965–5973.
  4. Kanfi Y., Peshti V., Gil R., Naiman S., Nahum L.,Levin E., Kronfeld-Schor N., Cohen HY. Sirt-6 protects against pathological damage caused by diet-induced obesity. Aging Cell. 2010, Аpr. 9(2), рр. 162–173.
  5. Sharma A., Diecke S., Zhang WY., Lan F., He C. Mordwinkin NM., Chua KF., Wu JC. The role of Sirt-6 protein in aging and reprogramming of human induced pluripotent stem cells. J. Biol. Chem. 2013, Jun 21,288(25), рр. 18439–18447.
  6. Кишкун А.А. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции».М., «ГЭОТАР-Медиа», 2008, стр. 973.

Поделиться

Подписаться на ежедневный дайджест 1nep.ru

Другие статьи по темам

Беременность. Кормление. Косметические процедуры Статьи Беременность. Кормление. Косметические процедуры
Анатомический курс в бархатный сезон у моря Обзор Анатомический курс в бархатный сезон у моря
Организаторы объявили осеннюю выставку InterCHARM крупнейшей за всю историю Обзор Организаторы объявили осеннюю выставку InterCHARM крупнейшей за всю историю

Читайте также

FDA предупреждает о нелегальных филлерах FDA предупреждает о нелегальных филлерах
Обогащенная плазма уменьшает время реабилитации после липофилинга Обогащенная плазма уменьшает время реабилитации после липофилинга
Лазерный аппарат SculpSure получил отметку CE для лечения субментальной области Лазерный аппарат SculpSure получил отметку CE для лечения субментальной области

Комментарии (0)

Войти по логину портала 1nep.ru или с помощью
img img