Исследование сукцинатзависимых механизмов активности Hyalual (Куприянова А.В., Кирова Ю.И., 2019), в ходе которого был выявлен сукцинатный рецептор SUCNR1 в коже, позволил методом иммуногистохимии установить наличие сукцинатного рецептора SUCNR1 в фибробластах, кератиноцитах, эндотелиоцитах, тучных клетках, макрофагах. Наиболее высокий уровень экспрессии SUCNR1 был обнаружен в макрофагах, что позволило рассматривать их главной мишенью воздействия с целью стимуляции процессов регенерации и реновации (редермализации) кожи препаратом Hyalual.
Недавние исследования (2016–2018) регуляции морфофункционального состояния макрофагов свидетельствуют о вовлечении системы сукцинат/SUCNR1 в формирование репаративного (противовоспалительного, М2) фенотипа макрофагов (Littlewood-Evans et al., 2016; Rubic-Schneider et al., 2017; van Diepen et al., 2017). Дермальные макрофаги представляют собой основную популяцию иммунных клеток кожи, которые, помимо иммунной функции (фагоцитоз, секреция цитокинов и презентация антигена), опосредуют механизмы развития ткани, тканевого гомеостаза, воспаления и репарации (Harvey et al., 2012; Kasraie et al., 2013). По данным литературы, макрофаги 1-го типа (провоспалительный фенотип, М1) играют ключевую роль в воспалении. Одной из широко известных теорий старения является теория инфламейджинга (хронического воспаления в коже, в процессе которого и формируются основные признаки старения – тусклый цвет лица, нарушения микрорельефа кожи, формирование дермальных депрессий, пигментации и других признаков, по которым мы привыкли определять состояние кожи). В настоящее время придается большое значение резидентным макрофагам в развитии инфламейджинга. В начале воспаления макрофаги активируются, происходит индукция более 400 генов, необходимых для элиминации бактерий и регуляции других клеток, посредством секреции цитокинов и хемокинов. Макрофаги 1-го типа являются самыми активными тканевыми продуцентами янтарной кислоты, что связано с активацией в них гликолитической продукции АТФ и частичной блокадой цикла Кребса (Diskin et al., 2018). Выброс янтарной кислоты М1-макрофагами во внеклеточное пространство приводит к индукции SUCNR1 и последующей их поляризации в репаративный / противовоспалительный М2-фенотип. Показано, что экспрессия SUCNR1 в М2 увеличена по сравнению с М1 (Diepen et al., 2017). Таким образом, рецепторы SUCNR1 вовлекаются в регуляцию смены фаз воспаления и формирование М2-фенотипа макрофагов, реализующих экспрессию широкого спектра ростовых факторов, которые реализуют механизмы ангиогенеза, пролиферации фибробластов, формирования дермального матрикса, что в целом влияет на скорость и качество репаративных процессов в коже, в том числе и на процессы восстановления внешнего вида кожи и активацию в ней процессов омоложения. Маркерами М2-фенотипа макрофагов являются VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), TGFb1 (трансформирующий фактор роста; иммуносупрессивный цитокин; ограничивает хемотаксис нейтрофилов, инициирует дифференциацию миофибробластов и синтез коллагена), FGF2 (фактор роста фибробластов) (Jetten et al., 2014; Lucas et al., 2010; Ruckerl et al., 2014).
Учитывая результаты предыдущего этапа исследования (увеличение количества фибробластов, плотности сети микрососудов и коллагеновых волокон), было принято решение о дальнейшем изучения SUCNR1-зависимых механизмов активности препарата Hyalual ввиду больших перспектив его использования для эстетической и других отраслей медицины, где вопрос реновации и регенерации кожи является основным.
Целью следующего этапа исследования являлось изучение роли сукцинат/SUCNR1 в регуляции экспрессии ростовых факторов в коже.
Главная задача заключалась в определении уровня экспрессии сукцинатного рецептора SUCNR1/GPR91 и ростовых факторов VEGF, TGFb1, FGF2 в коже передней брюшной стенки крыс через 1-е, 3-и, 7-е сутки после однократной процедуры внутрикожного введения препарата Hyalual.
Работа выполнялась на базе ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», для выполнения работы были использованы следующие препараты: коммерческий сукцинатсодержащий препарат Hyalual® (препарат для курсовой процедуры редермализации, инъекционная форма; концентрация гиалуроновой кислоты 1,1%, 1,8%, 2,2%; содержание сукцината 1,6%), физраствор (инъекционная форма), 1,6% раствор сукцината натрия, раствор гиалуроновой кислоты (коммерческая инъекционная форма), препарат с содержанием пептидов (коммерческая инъекционная форма).
Введение препаратов было произведено 18.12.2018 г. Внутрикожное введение препарата Hyalual (и препаратов сравнения) проводилось однократно. Взятие образцов кожи выполняли через 1-е, 3-и, 7-е сутки после введения препаратов.
Метод позволяет, сочетая белковый электрофорез и применение антител, проводить высокоспецифичную идентификацию белков в лизатах биологических тканей.
Для экстракции SUCNR1, VEGF, TGFb1, FGF2 использовали два буфера:
Затем вестерн-блоты инкубировали в растворе первых поликлональных антител (Abcam, США; anti-GPR91 antibody (ab41505), anti-VEGF antibody (ab53465), anti-TGFβ1 antibody (ab92486), anti-FGF2 antibody (ab8880) в разведении 1:500. Детектирование белков осуществляли в реакции с ECL-реагентами (Pierce Biotechnology, Inc., США) на пленку фирмы Kodak с последующей денситометрией в программе Adobe Photoshop. О содержании искомых белков судили по плотности окрашивания полосы связывания антител с белком. Результат выражали в относительных денситометрических единицах (ОДЕ).
Статистический анализ данных проводили с помощью программы «Statistica 10» с использованием непараметрического рангового U-критерия Уилкоксона (Уилкоксона-Манна-Уитни). Различия между сравниваемыми группами считали статистически достоверными при p<0,05.
По данным вестерн-блот анализа уровень экспрессии сукцинатного рецептора Hyalual и раствором сукцината Na (рис. 1 А, рис. 2) увеличивался и образцах кожи, инъецированных Hyalual и раствором сукцината Na (рис. 1 А, рис. 2). В других образцах, инъецированных однократно физраствором, гиалуроновой кислотой, пептидсодержащим препаратом, изменения в уровне экспрессии SUCNR1 отсутствовали (рис. 1 А, рис.2). Это подтверждает высочайшую тропность SUCNR1 именно к Hyalual и раствором сукцината Na (рис. 1 А, рис. 2) и отсутствие влияния других веществ, участвовавших в эксперименте, на активацию SUCNR1-рецептора.
Уровень VEGF значительно увеличивался только в образцах кожи, инъецированных Hyalual либо раствором сукцината Na (рис. 1 Б, рис. 2), составляя 150% в сравнении с контролем (1-е сутки после введения физраствора). У инъецированных гиалуроновой кислотой также отмечалось увеличение уровня VEGF, которое не превышало 20% относительно контроля. Экспрессия VEGF не менялась в образцах кожи, инъецированных физраствором, в образце, обработанном препаратом, содержащим пептиды, экспрессия VEGF составила не более 15 % от начального уровня.
Рис. 1. Фотографии и количественный анализ иммуноблотов лизатов кожи крыс, подвергнутых однократной процедуре внутрикожного введения Hyalual и препаратов сравнения (физраствор, раствор сукцината Na, гиалуроновой кислоты, пептидсодержащий препарат). Диаграммы отражают динамику уровня экспрессии SUCNR1/GPR91, VEGF, FGF2, TGFb1 в образцах кожи через 1-е, 3-и, 7-е сутки после введения препаратов.
Рис. 2. Сводная диаграмма динамики уровня экспрессии SUCNR1/GPR91, VEGF, FGF2, TGFb1 в образцах кожи в первые семь суток после однократной процедуры внутрикожного введения сукцинатсодержащих препаратов (Hyalual, раствор сукцината Na) и препаратов сравнения (физраствор, гиалуроновая кислота, пептид).
Полученные данные подтверждают связь сукцинат/SUCNR1 сигнализации с механизмами ангиогенеза и демонстрируют универсальность ангиогенных эффектов системы сукцинат/SUCNR1, проявляющихся в разных тканях.
Индукция FGF2 отмечалась в образцах кожи всех экспериментальных групп (рис. 1В, 2), однако увеличение уровня экспрессии FGF2 на 200% выявляли только в образцах, получавших Hyalual либо раствор сукцината Na. В других группах сравнения (гиалуроновая кислота, пептиды) уровень экспрессии факторов роста не превышал 140% от контроля (1-е сутки после инъекции физ. раствора). Соответственно, Hyalual является более активными в отношении стимуляции пролиферации фибробластов, и именно эти вещества необходимо рассматривать в первую очередь для стимуляции синтеза коллагена в коже.
Максимальное увеличение уровня экспрессии отмечалось для TGFb1 и составляло в образцах, инъецированных Hyalual либо раствором сукцината Na (в 2 и 3 раза, соответственно), в то время как в других группах сравнения (гиалуроновая кислота, пептидсодержащий препарат) не превышало 50% (рис. 1Г, рис. 2). В образцах, инъецированных физраствором, уровень TGFb1 не менялся.
Слабая индукция ростовых факторов наблюдалась в группах сравнения (инъекция физраствора, гиалуроновой кислоты, пептидсодержащий препарат) не была связана с индукцией сукцинатного рецептора SUCNR1 и могла быть вызвана повреждением кожи в ходе однократной процедуры внутрикожного введения (20 инъекций на площади кожи в 10 см2). Данный факт подтверждает, что травма иглой также вызывает репарацию кожи в месте травмы.
Таким образом, в проведенном исследовании была выявлена сопряженная индукция сукцинатного рецептора SUCNR1/GPR91 и всех исследованных ростовых факторов (VEGF, FGF2, TGFb1) в образцах, инъецированных сукцинатсодержащими препаратами (Hyalual и сукцинат Na). Формула Hyalual является при этом максимально эффективной (выраженная индукция всех ростовых факторов) и безопасной (отрицательная динамика к 7-м суткам фактора роста VEGF-фактора роста сосудов отличие монокомпонентного сукцината Na, который к 7-м суткам показал положительную динамику, что является неблагоприятным прогностическим признаком в прогнозе развития опухолевых процессов).
Полученные данные согласуются с результатами I этапа исследования, в ходе которого стандартный курс введения Hyalual (3-кратно с двухнедельными интервалами) сопровождался увеличением количества фибробластов, плотности сосудистой сети и плотности коллагеновых волокон. В ходе I этапа исследования использовались методики иммуногистохимического анализа кожи и анализ гистологических срезов.
В ходе выполнения второго этапа исследования было обнаружено прямое влияние введения Hyalual на уровень синтеза эндогенных факторов роста, которые влияют непосредственно на скорость регенерации и реновации тканей. Также была доказана возможность непосредственно влиять на процессы хронического воспаления и выявлена возможность с помощью сукцинатсодержащего препарата Hyalual осознанно запускать процессы поляризации макрофагов в коже (провоспалительного фенотипа М1 в противовоспалительный фенотип М2), что в свою очередь открывает огромные возможности для врачей различных специальностей, в том числе косметологов, дерматологов, пластических хирургов, в запланированной инициации процессов регенерации, репарации и омоложения, а также и блокаде негативных процессов в тканях, связанных с наличием хронического воспаления, т. к. широко известен факт, что процессы хронического воспаления являются основными в патогенезе старения.
2410
Комментарии