Материалы портала предназначены исключительно для врачей и специалистов клиник
Закрыть
facebook youtube instagram
Вход
instagram youtube facebook

Репрограммирование дермы как важнейший этап репарации и реновации кожи

29.01.2020
1418
4 мин на прочтение
Куприянова Анна Валерьевна
Публикуем результаты научного исследования, изучавшего влияние препарата Hyalual на процессы хронического воспаления и скорость регенерации и реновации тканей за счет воздействия на макрофаги

Исследование сукцинатзависимых механизмов активности Hyalual (Куприянова А.В., Кирова Ю.И., 2019), в ходе которого был выявлен сукцинатный рецептор SUCNR1 в коже, позволил методом иммуногистохимии установить наличие сукцинатного рецептора SUCNR1 в фибробластах, кератиноцитах, эндотелиоцитах, тучных клетках, макрофагах. Наиболее высокий уровень экспрессии SUCNR1 был обнаружен в макрофагах, что позволило рассматривать их главной мишенью воздействия с целью стимуляции процессов регенерации и реновации (редермализации) кожи препаратом Hyalual.

Недавние исследования (2016–2018) регуляции морфофункционального состояния макрофагов свидетельствуют о вовлечении системы сукцинат/SUCNR1 в формирование репаративного (противовоспалительного, М2) фенотипа макрофагов (Littlewood-Evans et al., 2016; Rubic-Schneider et al., 2017; van Diepen et al., 2017). Дермальные макрофаги представляют собой основную популяцию иммунных клеток кожи, которые, помимо иммунной функции (фагоцитоз, секреция цитокинов и презентация антигена), опосредуют механизмы развития ткани, тканевого гомеостаза, воспаления и репарации (Harvey et al., 2012; Kasraie et al., 2013). По данным литературы, макрофаги 1-го типа (провоспалительный фенотип, М1) играют ключевую роль в воспалении. Одной из широко известных теорий старения является теория инфламейджинга (хронического воспаления в коже, в процессе которого и формируются основные признаки старения – тусклый цвет лица, нарушения микрорельефа кожи, формирование дермальных депрессий, пигментации и других признаков, по которым мы привыкли определять состояние кожи). В настоящее время придается большое значение резидентным макрофагам в развитии инфламейджинга. В начале воспаления макрофаги активируются, происходит индукция более 400 генов, необходимых для элиминации бактерий и регуляции других клеток, посредством секреции цитокинов и хемокинов. Макрофаги 1-го типа являются самыми активными тканевыми продуцентами янтарной кислоты, что связано с активацией в них гликолитической продукции АТФ и частичной блокадой цикла Кребса (Diskin et al., 2018). Выброс янтарной кислоты М1-макрофагами во внеклеточное пространство приводит к индукции SUCNR1 и последующей их поляризации в репаративный / противовоспалительный М2-фенотип. Показано, что экспрессия SUCNR1 в М2 увеличена по сравнению с М1 (Diepen et al., 2017). Таким образом, рецепторы SUCNR1 вовлекаются в регуляцию смены фаз воспаления и формирование М2-фенотипа макрофагов, реализующих экспрессию широкого спектра ростовых факторов, которые реализуют механизмы ангиогенеза, пролиферации фибробластов, формирования дермального матрикса, что в целом влияет на скорость и качество репаративных процессов в коже, в том числе и на процессы восстановления внешнего вида кожи и активацию в ней процессов омоложения. Маркерами М2-фенотипа макрофагов являются VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), TGFb1 (трансформирующий фактор роста; иммуносупрессивный цитокин; ограничивает хемотаксис нейтрофилов, инициирует дифференциацию миофибробластов и синтез коллагена), FGF2 (фактор роста фибробластов) (Jetten et al., 2014; Lucas et al., 2010; Ruckerl et al., 2014).

Учитывая результаты предыдущего этапа исследования (увеличение количества фибробластов, плотности сети микрососудов и коллагеновых волокон), было принято решение о дальнейшем изучения SUCNR1-зависимых механизмов активности препарата Hyalual ввиду больших перспектив его использования для эстетической и других отраслей медицины, где вопрос реновации и регенерации кожи является основным.

Целью следующего этапа исследования являлось изучение роли сукцинат/SUCNR1 в регуляции экспрессии ростовых факторов в коже.

Главная задача заключалась в определении уровня экспрессии сукцинатного рецептора SUCNR1/GPR91 и ростовых факторов VEGF, TGFb1, FGF2 в коже передней брюшной стенки крыс через 1-е, 3-и, 7-е сутки после однократной процедуры внутрикожного введения препарата Hyalual.

Материалы и методы

Работа выполнялась на базе ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», для выполнения работы были использованы следующие препараты: коммерческий сукцинатсодержащий препарат Hyalual® (препарат для курсовой процедуры редермализации, инъекционная форма; концентрация гиалуроновой кислоты 1,1%, 1,8%, 2,2%; содержание сукцината 1,6%), физраствор (инъекционная форма), 1,6% раствор сукцината натрия, раствор гиалуроновой кислоты (коммерческая инъекционная форма), препарат с содержанием пептидов (коммерческая инъекционная форма).

Схема эксперимента

Введение препаратов было произведено 18.12.2018 г. Внутрикожное введение препарата Hyalual (и препаратов сравнения) проводилось однократно. Взятие образцов кожи выполняли через 1-е, 3-и, 7-е сутки после введения препаратов.

Методы объективизации данных

Иммуноблоттинг (вестерн-блот анализ)

Метод позволяет, сочетая белковый электрофорез и применение антител, проводить высокоспецифичную идентификацию белков в лизатах биологических тканей.

Для экстракции SUCNR1, VEGF, TGFb1, FGF2 использовали два буфера:

  1. Гипотонический;
  2. Цитоплазматический.

Затем вестерн-блоты инкубировали в растворе первых поликлональных антител (Abcam, США; anti-GPR91 antibody (ab41505), anti-VEGF antibody (ab53465), anti-TGFβ1 antibody (ab92486), anti-FGF2 antibody (ab8880) в разведении 1:500. Детектирование белков осуществляли в реакции с ECL-реагентами (Pierce Biotechnology, Inc., США) на пленку фирмы Kodak с последующей денситометрией в программе Adobe Photoshop. О содержании искомых белков судили по плотности окрашивания полосы связывания антител с белком. Результат выражали в относительных денситометрических единицах (ОДЕ).

Статистический анализ данных проводили с помощью программы «Statistica 10» с использованием непараметрического рангового U-критерия Уилкоксона (Уилкоксона-Манна-Уитни). Различия между сравниваемыми группами считали статистически достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По данным вестерн-блот анализа уровень экспрессии сукцинатного рецептора Hyalual и раствором сукцината Na (рис. 1 А, рис. 2) увеличивался и образцах кожи, инъецированных Hyalual и раствором сукцината Na (рис. 1 А, рис. 2). В других образцах, инъецированных однократно физраствором, гиалуроновой кислотой, пептидсодержащим препаратом, изменения в уровне экспрессии SUCNR1 отсутствовали (рис. 1 А, рис.2). Это подтверждает высочайшую тропность SUCNR1 именно к Hyalual и раствором сукцината Na (рис. 1 А, рис. 2) и отсутствие влияния других веществ, участвовавших в эксперименте, на активацию SUCNR1-рецептора.

Уровень VEGF значительно увеличивался только в образцах кожи, инъецированных Hyalual либо раствором сукцината Na (рис. 1 Б, рис. 2), составляя 150% в сравнении с контролем (1-е сутки после введения физраствора). У инъецированных гиалуроновой кислотой также отмечалось увеличение уровня VEGF, которое не превышало 20% относительно контроля. Экспрессия VEGF не менялась в образцах кожи, инъецированных физраствором, в образце, обработанном препаратом, содержащим пептиды, экспрессия VEGF составила не более 15 % от начального уровня.

Hyalual, Результаты исследования
Hyalual, Результаты исследования
Hyalual, Результаты исследования
Hyalual, Результаты исследования

Рис. 1. Фотографии и количественный анализ иммуноблотов лизатов кожи крыс, подвергнутых однократной процедуре внутрикожного введения Hyalual и препаратов сравнения (физраствор, раствор сукцината Na, гиалуроновой кислоты, пептидсодержащий препарат). Диаграммы отражают динамику уровня экспрессии SUCNR1/GPR91, VEGF, FGF2, TGFb1 в образцах кожи через 1-е, 3-и, 7-е сутки после введения препаратов.

Hyalual, Результаты исследования

Рис. 2. Сводная диаграмма динамики уровня экспрессии SUCNR1/GPR91, VEGF, FGF2, TGFb1 в образцах кожи в первые семь суток после однократной процедуры внутрикожного введения сукцинатсодержащих препаратов (Hyalual, раствор сукцината Na) и препаратов сравнения (физраствор, гиалуроновая кислота, пептид).

Полученные данные подтверждают связь сукцинат/SUCNR1 сигнализации с механизмами ангиогенеза и демонстрируют универсальность ангиогенных эффектов системы сукцинат/SUCNR1, проявляющихся в разных тканях.

Индукция FGF2 отмечалась в образцах кожи всех экспериментальных групп (рис. 1В, 2), однако увеличение уровня экспрессии FGF2 на 200% выявляли только в образцах, получавших Hyalual либо раствор сукцината Na. В других группах сравнения (гиалуроновая кислота, пептиды) уровень экспрессии факторов роста не превышал 140% от контроля (1-е сутки после инъекции физ. раствора). Соответственно, Hyalual является более активными в отношении стимуляции пролиферации фибробластов, и именно эти вещества необходимо рассматривать в первую очередь для стимуляции синтеза коллагена в коже.

Максимальное увеличение уровня экспрессии отмечалось для TGFb1 и составляло в образцах, инъецированных Hyalual либо раствором сукцината Na (в 2 и 3 раза, соответственно), в то время как в других группах сравнения (гиалуроновая кислота, пептидсодержащий препарат) не превышало 50% (рис. 1Г, рис. 2). В образцах, инъецированных физраствором, уровень TGFb1 не менялся.

Слабая индукция ростовых факторов наблюдалась в группах сравнения (инъекция физраствора, гиалуроновой кислоты, пептидсодержащий препарат) не была связана с индукцией сукцинатного рецептора SUCNR1 и могла быть вызвана повреждением кожи в ходе однократной процедуры внутрикожного введения (20 инъекций на площади кожи в 10 см2). Данный факт подтверждает, что травма иглой также вызывает репарацию кожи в месте травмы.

Таким образом, в проведенном исследовании была выявлена сопряженная индукция сукцинатного рецептора SUCNR1/GPR91 и всех исследованных ростовых факторов (VEGF, FGF2, TGFb1) в образцах, инъецированных сукцинатсодержащими препаратами (Hyalual и сукцинат Na). Формула Hyalual является при этом максимально эффективной (выраженная индукция всех ростовых факторов) и безопасной (отрицательная динамика к 7-м суткам фактора роста VEGF-фактора роста сосудов отличие монокомпонентного сукцината Na, который к 7-м суткам показал положительную динамику, что является неблагоприятным прогностическим признаком в прогнозе развития опухолевых процессов).

Полученные данные согласуются с результатами I этапа исследования, в ходе которого стандартный курс введения Hyalual (3-кратно с двухнедельными интервалами) сопровождался увеличением количества фибробластов, плотности сосудистой сети и плотности коллагеновых волокон. В ходе I этапа исследования использовались методики иммуногистохимического анализа кожи и анализ гистологических срезов.

Вывод

В ходе выполнения второго этапа исследования было обнаружено прямое влияние введения Hyalual на уровень синтеза эндогенных факторов роста, которые влияют непосредственно на скорость регенерации и реновации тканей. Также была доказана возможность непосредственно влиять на процессы хронического воспаления и выявлена возможность с помощью сукцинатсодержащего препарата Hyalual осознанно запускать процессы поляризации макрофагов в коже (провоспалительного фенотипа М1 в противовоспалительный фенотип М2), что в свою очередь открывает огромные возможности для врачей различных специальностей, в том числе косметологов, дерматологов, пластических хирургов, в запланированной инициации процессов регенерации, репарации и омоложения, а также и блокаде негативных процессов в тканях, связанных с наличием хронического воспаления, т. к. широко известен факт, что процессы хронического воспаления являются основными в патогенезе старения.

Источники:

  1. Chernykh E.R., Shevela E.Y., Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Petrovsky Y.L., Ostanin A.A. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell. Ther. Transplant. 2010. .2
  2. Diepen J.A., Robben J.H., Hooiveld G.J., Carmone C., Mohammad A., Boutens L. et al. SUCNR1-mediated chemotaxis of macrophages aggravates obesity-induced inflammation and diabetes. Diabetologia. 2017. № 60. P. 1304–1313.
  3. Diskin C., Palsson-McDermott E.M. Metabolic modulation in macrophage effector function. Frontiers in Immunology. 2018 V. 9. P. 270-287.
  4. Hamel D., Sanchez M., Duhamel F., Roy O., Honore J.-C., Noueihed B., Zhou T., Nadeau-Vallee M., Hou X., Lavoie J.-C., Mitchell G., Mamer O. A., Chemtob S. G-protein–coupled receptor 91 and succinate are key contributors in neonatal postcerebral hypoxia-ischemia recovery. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014. № 34. P. 285-293.
  5. Harvey N.L., Gordon E.J. Deciphering the roles of macrophages in developmental and inflammation stimulated lymphangiogenesis. Vascular Cell. 2012. 4:1-15.
  6. Jetten N., Verbruggen S., Gijbels M.J., Post M.J., De Winther M.P., Donners M.M. Anti-inflammatory M2, but not pro-inflammatory M1 macrophages promote angiogenesis in vivo. Angiogenesis. 2014. V. 17. № 1. P. 109-118.
  7. Kasraie S., Werfe T. Role of Macrophages in the pathogenesis of atopic dermatitis. Mediators of Inflammation. 2013. V. 2013. № 942375. P. 1-15.
  8. Littlewood-Evans A, Sarret S, Apfel V, Loesle P, Dawson J, Zhang J, et al. GPR91 senses extracellular succinate released from inflammatory macro-phages and exacerbates rheumatoid arthritis. J Exp Med (2016) 213(9): 1655–62. doi:10.1084/jem.20160061 88.
  9. Lucas T., Waisman A., Ranjan R., Roes J., Krieg T., Muller W. et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. The Journal of Immunology. 2010. № 184. P. 3964–3977.
  10. Rubic-Schneider T, Carballido-Perrig N, Regairaz C, Raad L, Jost S, Rauld C, et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy (2017) 72(3):444–52. doi:10.1111/all.13005 89.
  11. Ruckerl D., Allen J.E. Macrophage proliferation, provenance, and plasticity in macroparasite infection. Immunological Reviews. 2014. V. 262. P. 113–133.
  12. Sapieha P., Sirinyan M., Hamel D., Zaniolo K., Joyal J.S., Cho J.H. et al. The succinate receptor GPR91 in neurons has a major role in retinal angiogenesis. Nat Med. 2008. № 14. P. 1067–1076.
  13. Sorrell J. M., Caplan A.I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 2004. V. 117. № 5. P. 667-675.
  14. van Diepen JA, Robben JH, Hooiveld GJ, Carmone C, Alsady M, Boutens L, et al. SUCNR1-mediated chemotaxis of macrophages aggravates obesi-ty-induced inflammation and diabetes. Diabetologia (2017) 60(7):1304–13.

Комментарии

(0) комментариев
Войти чтобы оставить комментарий

Еще по теме

Тимолол не оправдал себя в лечении папулопустулозной розацеа
Регенеративная медицина
Тимолол не оправдал себя в лечении папулопустулозной розацеа
Однако у вещества обнаружились преимущества в лечении невоспалительных форм акне и уменьшении теланг...
Исследование показало рост случаев аллергии на прополис
Регенеративная медицина
Исследование показало рост случаев аллергии на прополис
Число случаев кожной аллергии увеличилось более чем вдвое – такие результаты опубликованы в Британск...
Измерена активность сальных желез и порфиринов на коже лица и головы
Регенеративная медицина
Измерена активность сальных желез и порфиринов на коже лица и головы
Дерматологи Университета Сан-Паулу также изучили экстракт гуараны для подавления активности сальных ...