Экспериментально-клинические исследования дермамодулятора Aquashine

Специалисты Института красоты Fijie совместно с лабораторией клеточных технологий Института акушерства и гинекологии имени Отта и научно-исследовательским центром CAREGEN, провели исследование влияния препарата Aquashine на фибробластах кожи человека.

Зарема Газитаева 
врач, пластический хирург, 
Институт красоты Fijie

Дермамодулятор Aquashine, разработанный на основе запатентованных биомиметических пептидов, трофического комплекса и гиалуроновой кислоты специалистами концерна Caregen, обладает высокой эффективностью и демонстрирует превосходные клинические результаты. Это подтверждают приведенные ниже исследования о влиянии препарата на кожу, проводимые в рамках предрегистрационного исследования.

Материалы и методы

Эксперимент 1

С помощью иммуноцитохимических методов исследовали влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию сигнальных молекул в культуре фибробластов человека (7-й и 15-й пассажи). 7-й пассаж соответствует зрелой коже, а 15-й – увядающей. Применяли первичную культуру клеток, фибробласты выделяли из кожи век, полученной в результате блефаропластики, проведенной женщине 45 лет. Исследуемый комплекс добавляли в культуру из расчета 2 мкг/мл на чашку Петри; в качестве контроля применяли физиологический раствор в эквивалентных дозах.

Эксперимент 2

Определяли иммуногистохимические маркеры в биоптатах кожи человека до и после интрадермального введения препарата Aquashine на разных сроках: через 1 и 2 недели после однократного введения, а также через неделю после двукратного введения (с интервалом в 2 недели). Пациентке за месяц до проведения абдоминопластики с ее ведома и согласия, вводили исследуемый препарат в удаляемые впоследствии участки кожи правой половины передней брюшной стенки ниже пупка. Одновременно в зоны на левой стороне живота еженедельно ей вводили гель гиалуроновой кислоты (средний молекулярный вес – 1 000 000 Да, концентрация – 1%) с использованием папульной техники. Площадь обработки кожи каждым из препаратов составляла 20 см2, количество инъецируемого препарата 0,2 мл. Во время операции были взяты образцы кожи, фиксированы в растворе формалина и направлены в лабораторию. После окрашивания гематоксилином и эозином срезы исследованы иммуногистохимически с применением специфических антител.

Результаты исследования

Гистологическое исследование

На микрофотографиях было проведено измерение площади коллагеновых и эластиновых волокон (окрашенных в розовый цвет) и межклеточного вещества (светлые участки).

Чем больше площадь волокон по отношению к межклеточному веществу, тем больше коллагеновых волокон в образцах (рис. 1).

Было установлено, что максимальная площадь волокон по отношению к матриксу наблюдалась в образцах, прошедших двукратную обработку Aquashine, что проявлялось в увеличении толщины и плотности коллагеновых волокон. Максимальная площадь матрикса по отношению к площади коллагеновых и эластиновых волокон выявлена в образце, прошедшем обработку гиалуроновой кислотой.

Иммуногистохимическое исследование

Проколлаген

Для изучения синтетической активности фибробластов дермы было проведено исследование экспрессии проколлагена I типа – предшественника основного компонента внеклеточного матрикса, коллагена I типа. Измерялась оптическая плотность экспрессии, которая характеризует интенсивность иммуногистохимической реакции в препарате, является наиболее информативным показателем для данного маркера и косвенно позволяет судить о количестве исследуемого вещества в препарате.

Проколлаген – внутриклеточный предшественник коллагена, синтезируемый на полирибосомах, связанных с мембранами эндоплазматической сети. Макромолекула проколлагена состоит из трех спиралевидных, скрученных между собой белковых молекул. Проколлаген содержит дополнительную пептидную последовательность, которая называется пропептид и находится на амино- и карбоксильных концах. Когда макромолекулы покидают фибробласт, специальные ферменты «откусывают» активные группы и создают условия для образования коллагеновых волокон. Макромолекулы-нити, скручиваясь по пять штук, образуют филамент коллагена; несколько филаментов скручиваются и составляют фибриллу, которая, также скручиваясь, образует высокопрочный «канат» – коллагеновое волокно.

В исследованиях in vitro было выявлено достоверное усиление синтетической активности фибробластов на 7-м пассаже при применении пептидного комплекса по сравнению с контролем. Отмечалось увеличение проколлагена I типа не только по площади экспрессии, но и по показателю оптической плотности (рис. 2, табл. 1).

Максимальное значение показателя оптической плотности экспрессии проколлагена I типа in vivo наблюдалось при двукратной обработке препаратом и составляло 0,285 у.е., оно также было высоким при однократной обработке. Минимальное значение оптической плотности отмечено в контрольных образцах (рис. 3).

ТАБЛИЦА 1. Влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию проколлагена I типа в культуре фибробластов in vitro на 7-м и 15-м пассаже

AP-1

C возрастом увеличивается содержание проколлагена III типа в крови, что свидетельствует о процессе деградации соединительной ткани. Образование и стабилизация коллагеновых волокон обусловлены не только синтезом проколлагена фибробластами кожи, но и замедлением процесса деградации коллагена. Одним из основных соединений, регулирующих разрушение коллагеновых волокон, является транскрипционный фактор АР-1, который контролирует активность генов, кодирующих матриксные металлопротеиназы (ММР-1, ММР-2, ММР-3), повышая уровень их экспрессии. В результате происходит деградация различных типов коллагена дермы и параллельно с этим – активизация фактора АР-1, приводящая к уменьшению количества проколлагена I и III типа.

Транскрипционный фактор АР-1 (активизирующий протеин-1), состоящий из белков Fos- и Jun-семейств, регулирует экспрессию генов в ответ на разные стимулы, в том числе воздействие цитокинов, факторов роста, стресса, бактериальных и вирусных инфекций. Кроме того, АР-1 контролирует ряд клеточных процессов, запуская дифференциацию, пролиферацию и апоптоз, а также синтез ММР, разрушающих коллаген.

При введении пептидного комплекса в культуру фибробластов отмечалось статистически достоверное снижение площади экспрессии АР-1 в 2,1 раза по сравнению с контролем, причем на 15-м пассаже она была наиболее низкой и составляла 4,98±0,67% (рис. 4).

В образцах кожи, обработанных препаратом Aquashine, наблюдалась тенденция к снижению площади экспрессии транскрипционного фактора АР-1, она варьировалась от 2 до 6%, в то время как в образцах контроля была в пределах 7–14% (рис. 5, табл. 2).

ТАБЛИЦА 2. Влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию транскрипционного фактора АР-1 в культуре фибробластов in vitro на 7-м и 15-м пассаже

Ki-67

Белок Ki-67, являющийся маркером клеточной пролиферации и роста клеточной популяции, присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2 и митозе), но отсутствует в покоящихся клетках (G0). С возрастом наблюдается уменьшение экспрессии Кi-67 в фибробластах, в старых клетках он не индуцируется в ответ на действие фактора роста тромбоцитов PDGF (от англ. Platelet-derivedgrowthfactor), хотя эффективно воздействует на клетки молодых субъектов. Проведенные исследования показали, что в культуре фибробластов на 7-м пассаже отмечались статистически достоверные различия между опытной и контрольной группами по показателю процентного соотношения площади экспрессирующих Ki-67 ядер к общей площади ядер культуры. При введении в культуральную среду пептидного комплекса выявлено увеличение данного показателя по сравнению с контролем в 2, 3 раза (рис. 6), в то время как на 15-м пассаже – двукратное увеличение (рис. 7).

Таким образом, при добавлении пептидного комплекса даже в стареющие культуры наблюдается стимуляция деления фибробластов (табл. 3).

Параллельно с этим при исследовании маркера пролиферации клеток Ki-67 в образцах кожи in vivo показано, что наиболее интенсивное деление фибробластов наблюдалось после двукратного введения Aquashine, тогда как делящиеся клетки практически отсутствовали в контрольных образцах (рис.8).

ТАБЛИЦА 3. Влияние пептидного комплекса Aquashine на пролиферативную активность фибробластов в культуре клеток in vitro на 7-м и 15-м пассаже (тестировано по Кi -67)

Sirt-6

Маркер Sirt-6 относится к семейству сиртуинов – НАД-зависимых белков, обладающих деацетилазной или АДФ-рибозил трансферазной активностью.

Sirt-6 – регулятор транскрипции стабильности генома, теломерной целостности, репарации ДНК и метаболического гомеостаза – имеет важное значение для послеродового развития человека. Израильские ученые установили, что белок из семейства сиртуинов ассоциирован с увеличением продолжительности жизни млекопитающих. Результаты нового исследования, опубликованные в журнале Nature, свидетельствуют о том, что повышение экспрессии гена на 15,8% увеличивает продолжительность жизни мышей самцов. SIrt-6, ослабляя действие NF-κB (от англ. Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла), ингибирует клеточное старение.

Sirt-6 также играет важную роль в регуляции старения и долголетия. У нокаунтных по Sirt-6 мышей (с удаленными или неработоспособными данными генами) наблюдалось преждевременное старение, тяжелая лимфопения, потеря подкожного жира, остеопения и нарушение обмена веществ.

Введение в культуру фибробластов пептидного комплекса на 7-м пассаже незначительно сказывается на содержании Sirt-6, в то время как на 15-м пассаже – заметно его увеличивает, что говорит об активизации защитных механизмов преимущественно в стареющих клетках (рис. 9, табл. 4).

В образцах кожи in vivo также отмечается значительное увеличение содержания Sirt-6 после инъецирования препарата по сравнению с контролем, что свидетельствует о повышении выживаемости клеточного пула фибробластов увядающей кожи. Анализ площади экспрессии иммунопозитивных ядер по Sirt-6 показал, что во всех образцах кожи, обработанных препаратом Aquаshine, определялось увеличение количества иммунопозитивных ядер по отношению к контрольным образцам (гель гиалуроновой кислоты) (рис. 10).

ТАБЛИЦА 4. Влияние пептидного комплекса Aquashine на экспрессию фактора Sirt-6 фибробластами в культуре клеток in vitro на 7-м и 15-м пассаже

Выводы

Эластичность и упругость кожи. Под действием пептидного комплекса Aquashine значительно повышается синтетическая активность фибробластов, что подтверждается повышенной экспрессией проколлагена I типа.

Ускорение сниженных темпов обновления. Пептидный комплекс Aquashine в дозе 2 мкг/мл активизирует пролиферативную активность фибробластов кожи.

Повышение выживаемости клеточной популяции, замедление старения. Инкубация фибробластов кожи человека с пептидным комплексом Aquashine активизирует синтез Sirt-6. Это свидетельствует о запуске механизма поддержания стабильности ДНК, защиты теломер и других процессов, препятствующих старению.

Дермапротекция, защита от агрессивного воздействия свободных радикалов.

Пептидный комплекс Aquashine способствует достоверному снижению экспрессии транскрипционного фактора АР-1 по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о протективном действии исследуемых веществ, реализуемом посредством защиты коллагеновых волокон от деградации.

Проведенные исследования убедительно продемонстрировали высoкую активность препарата. Это позволяет с позиций доказательной медицины экстраполировать полученные результаты на клиническое использование и прогнозировать выраженный эффект лифтинга, уплотнения кожи и ее омоложения при использовании Aquashine в программах anti-age коррекции.

Рекомендуемая литература

1. Ameyar M., Wisniewska M., Weitzman JB. A role for AP-1 in apoptosis: the case.
2. Chen J., Zhou Y., Mueller-Steiner S., Chen LF.,Kwon H., Yi S., Mucke L., Gan L. Sirt-1 protectsagainst microglia-dependent amyloid-beta toxicity through inhibiting NF-kappaB.
3. Hess J., Angel P., Schorpp-Kistner M. AP-1subunits: quarrel and harmony among siblings.J. Cell.Sci. 2004, 117 (Pt 25), рр. 5965–5973.
4. Kanfi Y., Peshti V., Gil R., Naiman S., Nahum L.,Levin E., Kronfeld-Schor N., Cohen HY. Sirt-6 protects against pathological damage caused by diet-induced obesity. Aging Cell. 2010, Аpr. 9(2), рр. 162–173.
5. Sharma A., Diecke S., Zhang WY., Lan F., He C. Mordwinkin NM., Chua KF., Wu JC. The role of Sirt-6 protein in aging and reprogramming of human induced pluripotent stem cells. J. Biol. Chem. 2013, Jun 21,288(25), рр. 18439–18447.
6. Кишкун А.А. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции».М., «ГЭОТАР-Медиа», 2008, стр. 973.